Den mutagenese er dannelse av en eller flere mutasjoner i et genom , nøyaktig og frivillig. Denne metoden brukes til å modifisere strukturene til DNA , RNA og proteiner . Denne molekylærbiologiske teknikken ble utviklet av Michael Smith i 1978. Tilsynelatende oppsto ideen om stedstyrt mutagenese ham under en samtale med Clyde Hutchison i 1976 ved Cambridge Institute i England, da han jobbet med forberedelsen av oligonukleotider for å rense DNA-fragmenter. Denne store oppdagelsen ga ham Nobelprisen i kjemi i 1993 sammen med Karry Mullis , oppfinneren av Polymerase Chain Reaction .
Stedsstyrte mutagenesemetoder er basert på polymerasekjedereaksjonen (PCR). Mutasjonene ble introdusert ved bruk av oligonukleotidprimere som er syntetisert på forhånd. Disse primere er komplementære til villtypesekvensen bortsett fra nukleotidene som må muteres. PCR krever faktisk ikke streng komplementaritet mellom nukleotidprimeren og mål-DNA-sekvensen. På slutten av PCR-reaksjonen introduseres mutasjonene i produktene og kan være av tre typer:
1) Substitusjoner: en eller flere nukleotider erstattes av samme antall forskjellige nukleotider.
2) Innsettinger: ett eller flere nukleotider tilsettes målsekvensen.
3) Slettinger: ett eller flere nukleotider fjernes fra sekvensen.
En av de første tilnærmingene til stedstyrt mutagenese er basert på forlengelsen av overlappingen. Komplementære primere brukes til å generere DNA-fragmenter med overlappende ender ved PCR. Disse fragmentene kombineres, og deres hybridisering tillater forlengelse av overlappingsområdet. Mutasjoner introduseres på en spesifikk måte ved endringer av nukleotider i primersekvensen.
I praksis brukes to par primere til å utføre tre PCR-reaksjoner. Primere 1 og 2 bærer mutasjonen i deres 5'-region og er komplementære til hverandre. Primere 3 og 4 avgrenser mål-DNA som skal amplifiseres. Den første PCR utføres med primere 2 og 3 og gjør det mulig å amplifisere den venstre delen av mål-DNA inkludert den muterte regionen. Den andre PCR, utført med primere 1 og 4, produserer den rette delen av mål-DNA inkludert den muterte regionen. Renset, blandet og denaturert, kan produktene fra disse to PCRene hybridisere av den muterte regionen som er vanlig for dem. En tredje PCR med oligonukleotider 3 og 4 gjør det da mulig å oppnå fullstendig mål-DNA med mutasjonen.
Andre viktige tilnærminger inkluderer QuickChange vektor-stedrettet mutagenese.
Mange teknikker er mulige gjennom PCR :