FAST ( Fluorescence-Activating and absorption-Shifting Tag ) er et lite protein-merke som tillater fluorescerende merking av proteiner av interesse som det er genetisk smeltet til. Ikke-fluorescerende, i motsetning til naturlig fluorescerende proteiner som GFP , kan den selektivt knytte seg til en fluorogen kromofor avledet fra 4-hydroksybenzyliden-rodanin (HBR), selv ikke-fluorescerende i sin frie form. Det er komplekseringen mellom FAST og fluorogenet som utløser fluorescensen i systemet under virkning av en dobbel spektroskopisk endring: økning i fluorescenskvantumutbyttet og rød forskyvning av fluorogenabsorpsjonsbåndet. RASKT, lite 14 kDa protein ble generert av direkte evolusjon fra gult fotoaktivt protein (in) (PYP). Det FAST-fluorogene systemet kan brukes i fluorescensmikroskopi , i flowcytometri eller annen fluorimetrisk metode for å utforske de levende: biosensorer, proteinhandel , screening med høyt innhold til (in) , etc.
Oppfinnelsen av FAST ble først publisert i 2016 av forskere ved École normale supérieure i Paris .
FAST er en del av en hybrid tilnærming av selektiv merking av proteiner: et peptiddomene, kalt "tag", er genetisk smeltet sammen med et protein av interesse (ved å kombinere deres respektive gener ved transfeksjon eller infeksjon) og fungerer som et ankerpunkt for en syntetisk fluorescerende sonde.
Denne kjemogenetiske tilnærmingen er allerede implementert i flere systemer:
FAST ble oppnådd fra gult fotoaktivt protein (PYP), en naturlig fotoreseptor som ble funnet i Halorhodospira halophila (en) , en ekstremofil bakterie som lever i hypersaliske miljøer. Denne fotoreseptoren reagerer på blått lys takket være tilstedeværelsen av et para-hydroksykanaminsyremolekyl festet til en cysteinrest . Para-hydroksykanaminsyre har en struktur nær 4-hydroksybenzyliden-rodanin (HBR) og dens derivater som er fluorogener, dvs. de er ikke fluorescerende i løsning, men kan bli det når 'deres frihetsgrader er begrenset, for eksempel ved kompleksisering. PYP ble derfor mutert av rettet evolusjonsteknikk for å forsterke dets gjenkjenning av HBR-analoger og aktivering av deres fluorescens. Til slutt ble FAST generert ved innføring av ni mutasjoner.
To versjoner av FAST er beskrevet, forskjellige med en mutasjon:
GNLNTMFEWMIPTSRGPTKVK V HMKKALSGDSYWVFVKRV
GNLNTMFEWMIPTSRGPTKVK I HMKKALSGDSYWVFVKRV
I motsetning til systemene som er beskrevet ovenfor, har FAST derfor spesielt følgende to egenskaper:
Mange fluorogener er utviklet som tilbyr en rekke forskjellige farger og forskjellige tilhørigheter for FAST-taggen og dens derivater, for eksempel tdFAST. Noen av dem, ikke-permeant, det vil si at de ikke kan krysse cellemembranen, spesifikt markere membranen eller ekstracellulære proteiner, og dermed gjøre det mulig å følge deres trafikk fra oversettelsen til deres utskillelse.
FAST brukes til avbildning av anaerobe biofilmer takket være dens evne til å fluorescere selv i oksygenfattige medier i motsetning til GFP eller dets derivater . Av samme grunn gjør det det mulig å avbilde Clostridium , en anaerob bakterie som brukes til gjæring av biomasse, nærmere bestemt fermentering av aceton-butanol-etanol .
FAST kan også brukes til superoppløsningsmikroskopi av levende celler.