En DNA-brikke er en samling av DNA- molekyler festet i ordnede rader på en liten overflate som kan være glass , silisium eller plast . Denne nylige bioteknologien gjør det mulig å analysere ekspresjonsnivået til gener ( transkripsjoner ) i en celle , et vev, et organ, en organisme eller til og med en kompleks blanding, i et gitt øyeblikk og i en gitt tilstand i forhold til et utvalg av referanse.
DNA-chips kalles også genchips , biochips eller av de engelske begrepene " DNA-chip, DNA-microarray, biochip " . De franske begrepene DNA microarray og DNA microarray er også termer foreslått av Office québécois de la langue française .
Prinsippet for DNA-chip er basert på egenskapen besatt med denaturert DNA (enkelt tråd) av spontant reforme sin dobbeltspiralen når det er i nærvær av en komplementær tråd ( hybridisering reaksjon ). De fire kjernebasene av DNA ( A , G , C , T ) har faktisk det spesielle å parre to og to med hydrogenbindinger (A = T og T = A; G ≡ C og C ≡ G).
Vi snakker om sonde (syntetisk DNA-fragment som er representativt for genene hvis uttrykk vi ønsker å studere, kovalent festet til overflaten av biobrikken) og mål (mRNA vi vil identifisere og / eller kvantifisere (prøve)). Mål er fluorescerende merket (se nedenfor).
Microarrays kan brukes til å måle / oppdage RNA som vil eller ikke vil bli oversatt til proteiner. Forskere tale av ekspresjon analyse eller uttrykk profil . Siden det er mulig å feste opptil en million sonder på en biochip, utgjør DNA-mikroarrays en massiv tilnærming og har bidratt til revolusjonen innen genomikk , siden de tillater i et enkelt eksperiment å ha et estimat på uttrykket til flere titusenvis av gener. Men det er også et stort antall forskjellige applikasjoner som involverer DNA-chip-teknologi (screening for mutasjoner, resekvensering, DNA / protein-interaksjoner, mikrobiell økologi).
I praksis blir de totale RNAene ekstrahert fra cellene som studeres og noen ganger gjennomgår forsterkning som gjør det mulig å oppnå en tilstrekkelig mengde genetisk materiale for eksperimentet. Disse mRNAene blir deretter transformert til komplementære DNAer (cDNA) ved revers transkripsjonsteknikk og merket. Denne merkingen er nå levert av et fluorescerende molekyl ( fluorokrom ). Det er to overveiende fluorokromer: Cyanine 3 (Cy3) som fluorescerer i grønt og Cyanine 5 (Cy5) som fluorescerer i rødt. Målene som er merket (cDNA) blir så brakt i kontakt med brikken (bærer alle sonder på overflaten), dette trinnet kalles hybridisering. Hver streng av cDNA vil deretter hybridisere til prober som er komplementære til den for å danne en dobbeltstrenget probe / måldupleks. Biochippen vaskes deretter i spesifikke bad for å fjerne cDNA- strengene som ikke har hybridisert fordi de ikke er komplementære til prober som er festet på lysbildet. Biochip vil deretter bli analysert av en skanner med veldig høy oppløsning, ved excitasjonsbølgelengden til Cyanine 3 eller Cyanine 5. Det skannede bildet blir deretter analysert av datamaskinen for å knytte en verdi d intensitet ved hver sonde festet til biochipet og dermed bestemme om det har vært hybridisering for hver sonde.
Under et DNA-biochip-eksperiment som tar sikte på å sammenligne ekspresjon av gener mellom to forhold (for eksempel: sunn celle versus syk celle), blir de totale RNAene til de to populasjonene av celler ekstrahert og hver merket med en annen fluorokrom. De to prøvene blir deretter avsatt samtidig på biochipet, dette kalles konkurransedyktig hybridisering. For et gitt gen, hvis antall cDNA-molekyler som tilsvarer dette genet er større i en tilstand enn i den andre, vil hybridisering mellom disse cDNAene og de tilknyttede prober være favorisert. Etter å ha skannet biochippen i de to lengdene av de to fluorokromene som er brukt, er det således mulig å sammenligne intensiteten til det grønne signalet med det røde signalet og derfor vite for hvert gen som er studert i hvilken tilstand det er mest uttrykt.
Begynnelsen til DNA-mikroarrays begynte i 1991 med en publikasjon av Stephen Fodor (amerikansk forsker og grunnlegger av Affymetrix- selskapet ) om in situ- synteseteknologi . Deretter følger flere hendelser som spiller inn:
Det er to typer biochip-analyse:
En av styrkene til den enkeltkanals biochip er at en avvikende prøve ikke påvirker analysen av andre prøver. Omvendt, i biokanaler med to kanaler, er en enkelt prøve av dårlig kvalitet tilstrekkelig til drastisk å redusere kvaliteten på resultatene, selv om den andre målprøven er perfekt. En annen styrke er at data fra en enkeltkanals biochip lettere sammenlignes med andre biochips fra forskjellige eksperimenter. I tillegg er enkeltkanals biochip noen ganger den eneste mulige løsningen for visse applikasjoner.
Følgende tabell er hentet fra den engelske Wikipedia-siden .
| Navn på prosess eller teknologi | Beskrivelse |
|---|---|
| Genuttrykk | Dette er den mest kjente bruken av DNA-brikken. Ekspresjonen av gener sammenlignes mellom forskjellige gitte forhold eller over tid. Gjennom hybridisering og påfølgende bildeanalyse identifiserer denne prosessen hvilke gener som er over- eller underuttrykt i en gitt tilstand. Når disse genene har blitt identifisert, er det ytterligere nødvendig i silico-analyser, for eksempel klyngeanalyser for å samle gener med samme uttrykksprofil. Til slutt vil resultatene ofte bli bekreftet gen ved gen ved metoder som kvantitativ PCR eller Northern Blot. (genanalysemetoder) |
| Kromatinimmunutfelling | Biochipene kan også bruke fenomenet kromatinimmunutfelling (Chromatin immunoprecipitation on Chip, eller ChIP-On-Chip ). Denne metoden gjør det mulig å bestemme plasseringen av proteinbindingsstedet i genomet. |
| Polymorfisme | DNA-brikken kan også gjøre det mulig å oppdage polymorfisme, det vil si å identifisere punktpolymorfier av alleler i en populasjon eller mellom populasjoner, å forutsi utvikling av sykdommer i en populasjon, evaluere mutasjoner eller analysere koblingene mellom gener. |
| Flislegging | Disse sjetongene er viet til leting etter nye transkripsjoner (begrepet "transkribert gen" forstås å bety). Det vil si at hvert segment av kromosomet (ikke bare kjente gener) er målrettet av en sonde. En av interessene er å oppdage et stort antall ikke-kodende RNAer (for eksempel lange ikke-kodende RNAer for eksempel). Det er således mulig å lykkes med å kartlegge transkripsjonene, søke etter eksoner eller til og med søke etter transkripsjonsfaktorer . |
| Chimerisk genbiochip | Det er også biochips med et kimært gen (eller fusjonsgen). Prinsippet bak er at alternativ spleising på engelsk, eller alternativ spleising på fransk. En slik biochip kan da oppdage gener transkribert ved fusjon, derfor fra kreftprøver. |
| Sammenlignende genomisk hybridisering | En komparativ genomisk hybridiseringsbrikke er en DNA-brikke som brukes til å analysere endringer i antall kopier i DNA. Denne teknikken brukes hovedsakelig til å diagnostisere kreft og genetiske sykdommer. |
| GenID | Disse DNA-sjetongene brukes til å oppdage visse typer organismer i mat (for eksempel GMO ), mykoplasma i cellekultur, eller visse smittsomme midler for å diagnostisere sykdommer. Teknikken er hovedsakelig basert på polymerasekjedereaksjonen . |
Listen nedenfor er ikke ment å være uttømmende, men den gir en oversikt over bruksområdene til biochips.
Brikken er et lysbilde, vanligvis laget av glass, med tilnærmet liten størrelse (6 cm x 3 cm ), på hvilke det er festet prober som er komplementære til et fragment av nukleinsyre (DNA eller RNA) målrettet. Opptil en million sonder kan festes til en brikke, og dermed tillate analyse av flere titalls eller til og med hundretusenvis av gener.
Hvilke typer probe skal du sette på brikken?
| Oligonukleotider | Lange sonder | |
|---|---|---|
| Kutte opp | 15 - 70 hav | > 100 hav |
| fordeler | - SNP-deteksjon (polymorfisme)
- Levert "klar til å få øye på" |
- Ufølsom for alleler / varianter
- Stor mengdeproduksjon - Tilgjengelige samlinger (EST, BAC ...) - Dobbeltrådet, flere merkingsvalg, bedre genomdekning |
| Ulemper | - Følsom for alleler / varianter
- Kostnad for masseproduksjon - Utformingen av oligoene er et komplekst trinn |
- Lavere oppløsning
- Produksjonen av PCR- produkter er tung - Krysshybridiseringsproblem - Innsamlingsfeil (EST) |
Hvilke typer gener er involvert?
I seg selv eksisterer ingen kontraindikasjon angående typen gener som skal testes (gener med kjente eller ukjente funksjoner). For å være i stand til å hente pålitelig informasjon fra biochip-eksperimentene, er det tilrådelig å inkludere positive og negative kontrollprober for å verifisere og kontrollere riktig fremgang for hvert trinn i eksperimentet.
Denne metoden bruker lange sonder (omtrent hundre nukleotider) avsatt på lysbildet. Sondene syntetiseres før de blir avsatt på overflaten i rader med små dråper, eller flekker , (derav det engelske begrepet microarray , “microtableau”). Vi bruker fine nåler som styres av en robotarm som er nedsenket i flekkene. Nålerne vil deretter injisere overflødige sonder på hvert sted. Det endelige "rutenett" representerer nukleinsyreprofilene til de forberedte sonder og hver probe er klar til å hybridisere med målene.
Denne metoden er den enkleste, noe som gjør denne løsningen mer tilgjengelig for akademiske laboratorier . Den brukes av forskere og forskere over hele verden for å produsere de riktige sjetongene for deres behov. Sjetonger tilpasses enkelt for hvert eksperiment fordi forskere kan velge type og plassering av sonder, eller til og med syntetisere probene selv.
Forskere kan deretter generere egne målprøver, brukt til hybridisering med sonder, for til slutt å analysere sjetongene med eget utstyr. Dette gir en chip som er billigere (unngår kostnadene ved å kjøpe kommersielle chips) og som også passer til deres behov.
Sjetonger som er laget på denne måten, kan imidlertid ikke ha samme tetthet av sonder som sjetonger laget ved in situ- syntese .
Disse sjetongene er laget ved å syntetisere små DNA-sonder (<80-mer) direkte på bæreren (biochip) ved kjemisk syntese.
Et høyoppløselig bilde oppnås ved bruk av veldig høyoppløselige skannere (av størrelsesorden et mikrometer) som avslører sonden / målinteraksjonene ved eksitasjon av fluorkromene som bæres av målene. I Frankrike utvikler, produserer og markedsfører selskapet INNOPSYS et komplett utvalg av fluorescensskannere dedikert til lesing og analyse av denne typen lysbilder: InnoScan 710 (2 farger, 3 µm / piksel, InnoScan 710-IR, InnoScan 910 (2 farger) , 1 µm / piksel) og InnoScan 1100 (3 farger, 0,5 µm / piksel).
Programvare tolker intensiteten til pikslene i bildet for å utlede en digital måling av ekspresjonen til hvert gen.
Store datamengder genereres ved analyse av en DNA-brikke, og mange teknikker brukes til å tolke resultatene av eksperimentet. Disse teknikkene inkluderer: