Den homologe rekombinasjonen er en type genetisk rekombinasjon, hvor sekvensene av nukleotider byttes mellom molekyler av DNA identiske (homologe) eller lignende (homoeologe) ( figur 1 ). I vid forstand er homolog rekombinasjon en allestedsnærværende reparasjonsmekanisme for DNA-dobbeltstrengsbrudd. Hovedtrekket er bruken av et intakt homologt DNA-molekyl (som søsterkromatidet ) som en modell for gjenoppretting av nukleotidsekvensen til det skadede molekylet, og dermed deltar i genomets stabilitet. Oppløsning av sene mellomprodukter i denne reparasjonsveien kan føre til utveksling mellom det skadede mottaker- DNA-molekylet og det intakte donor- DNA-molekylet på et kryssnivå . Disse overgangene tillater spesielt fysisk tilknytning og genetisk utveksling mellom foreldrekromosomer under meiose , noe som gjør homolog rekombinasjon til en grunnleggende prosess for seksuell reproduksjon i mange organismer. Inaktivering av gener som koder for homologe rekombinante proteiner, gir følsomhet for visse typer kreft og infertilitet.
Mekanismen for homolog rekombinasjon, bevart i den levende verden, følger tre hovedfaser, initiert av et dobbeltstrenget DNA-brudd:
- En presynaptisk fase der bruddstedet gjenkjennes, delvis nedbrytes og hvor rekombinasjonsproteinene er samlet;
- en synaptisk fase som omfatter søk etter og utveksling av tråder med et intakt dobbeltstrenget DNA hvis sekvens er lik (homolog) til det skadede molekylet;
- en postsynaptisk fase der DNA-syntese initieres på strengutvekslingsstedet (som gjenoppretter sekvensen som er tapt ved bruddstedet ved bruk av intakt DNA som en mal), deretter oppløsningen av utvekslingsmellemproduktene til strengene.
Etter dannelsen av et dobbeltstrenget DNA-brudd initieres homolog rekombinasjon ved nedbrytning, på hver side av bruddet, av DNA-strengen orientert i 5'-3'-retningen. Dette trinnet, kalt reseksjon , avslører et enkeltstrenget DNA hvis ende er orientert 3 ', som senere kan brukes som en primer av DNA-polymeraser . I eukaryoter foregår reseksjon i to trinn: en kortdistansemekanisme initiert av spaltning av noen titalls nukleotider fra den innledende pause av MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) og CtIP-komplekset hos mennesker. En langdistansemekanisme gitt av en exonuklease (EXO1) og et helicase-endonukleasepar (BLM-DNA2) som eksponerer enkeltstrenget DNA på flere kilobaser.
RAD51 filamentmonteringKjerneproteinet i den homologe rekombinasjonsveien er Rad51 / RAD51 i eukaryoter ( RecA i prokaryoter), samlet i et nukleoproteinfilament på enkeltstrenget DNA generert ved reseksjon. Dens montering innebærer erstatning av RPA, et rikelig protein med høy affinitet for DNA som først binder enkeltstrenget DNA generert ved reseksjon. Denne erstatningen katalyseres av meglere, slik som BRCA2- proteinet hos mennesker. Andre proteiner assosieres med filamentet for å sikre stabiliteten og funksjonen, slik som paralogene til RAD51 og translokasen RAD54. Hver RAD51-monomer binder en triplett av nukleotider som beholder sin opprinnelige konformasjon ( dvs. DNA B ). Hver triplett skilles fra den neste ved å strekke fosfatgraden mellom RAD51-monomerene, noe som fører til en utvidelse av DNA-molekylet med 50%.
RAD51-filamentet bruker sekvensinformasjonen til enkeltstrenget DNA for å avhøre omkringliggende DNA-molekyler. Ettersom RAD51-filamentet har et langt, kontinuerlig kontaktområde, engasjerer det flere dobbeltstrengede DNA-molekyler, og multipliserer dermed antall lesehoder for homologisøk. Det lokalt engasjerte dobbeltstrengede DNA er destabilisert, noe som tillater forsøk fra Watson-Crick-assosiasjon med mottaker -enkeltstrenget DNA . Denne forskningen ledsages på det cytologiske nivået av en økning i mobiliteten til pauser i kjernen, noe som potensielt gjør det mulig å identifisere fjerne homologier, som det homologe kromosomet.
StrandinvasjonIdentifiseringen av homologi i RAD51-filamentet, når den overstiger en viss størrelse, fører til at RAD54-proteinet omdanner dette synaptiske komplekset til et mellomprodukt av sammenføyde DNA-molekyler hvis stabilitet ikke lenger avhenger av RAD51. Den mottaker og donor strenger er forbundet ved hjelp av Watson-Crick komplementaritet i en DNA "heterodupleks" innenfor en struktur som er kjent som en "forskyvning sløyfe" eller D-løkke. Denne strukturen kan demonteres av mange regulatoriske proteiner for homolog rekombinasjon, hvis virkning fører til større strenghet i valget av donor- DNA og fremmer genomets stabilitet.
3'-enden av det ødelagte molekylet er funnet hybridisert til sin intakte motstykke i D-sløyfen. En DNA-polymerase utvider denne enden ved å bruke det intakte komplementære DNA som en mal. Det er dette syntesetrinnet som tillater gjeninnhenting av informasjonen som går tapt på stedet for pausen.
VedtakNår syntesetrinnet er fullført, kan D-sløyfen demonteres eller løses. Flere undermekanismer forgrener seg fra denne mellomleddet.
SDSA (Synthesis-Dependent Strand Annealing)I SDSA-modellen demonteres D-sløyfen, og den utvidede DNA-enden kan knyttes til den andre enden av pausen ved hjelp av den nylig ervervede sekvensen. Deretter følger et DNA-syntesetrinn som fyller ut det enkeltstrengede DNA generert av reseksjonen på de to molekylene.
DSBR (Double-Strand Break Repair)DSBR-modellen postulerer fangst av den syntetisk fortrengte strengen i D-sløyfen av tråden på den andre siden av bruddet. Denne fangsten og DNA-syntesen som følger fører til dannelsen av et mellomprodukt som inneholder to heteroduplekser, med to Holliday-kryss ved grensen . Enzymer kalt "strukturselektive endonukleaser" gjenkjenner og spalter disse kryssene. Avhengig av delte tråder, vil oppløsningen føre til eller krysse over. En kryssoverføring innebærer translokasjon mellom det opprinnelig ødelagte molekylet og molekylet som fungerte som en matrise for reparasjonen. Dette resultatet unngås vanligvis i somatiske celler, men det kreves i kimceller for å oppnå den første meiotiske delingen .
BIR (Break Induced Replication)I BIR-modellen fortsetter DNA-syntese initiert ved D-sløyfen til slutten av kromosomet. Denne reparasjonsmodusen utføres hovedsakelig på nivået med et DNA-brudd som ikke har en andre ende, slik som de som genereres ved brudd på en replikasjonsgaffel.
Dobbeltstrengede lesjoner kan repareres ved homolog rekombinasjon eller ved ikke-homolog endeforbindelse (NHEJ). I motsetning til homolog rekombinasjon som bruker et intakt molekyl som mal, blir NHEJ ganske enkelt med i begge ender av pausen. NHEJ er aktiv gjennom hele cellesyklusen , mens homolog rekombinasjon bare er aktiv i S- og G2-fasen, når DNA har blitt replikert og bare en identisk, intakt og romlig nær kopi for reparasjon. Er funnet i form av søsterkromatiden . Avgjørelsespunktet mellom disse to reparasjonsveiene er reseksjonsproteinene: så snart en av de to delene av bruddet blir nedbrutt, blir substratet for NHEJ tapt. Dette valget er under kontroll av komplekse reguleringer dominert av antagonismen mellom 53BP1 (anti-reseksjon) og BRCA1 (pro-reseksjon) hos mennesker, hvis respektive innflytelse er gjenstand for, via posttranslasjonelle modifikasjoner ( fosforylering , sumoylering , ubiquitinering , etc.) i cellesyklusfasen. Spesielt er CDKs ( cyklinavhengige kinaser) , som påvirker aktiviteten til andre proteiner ved fosforylering , viktige regulatorer for homolog rekombinasjon i eukaryoter. I S. cerevisiae induserer CDK Cdc28 homolog rekombinasjon ved å fosforylere Sae2-proteinet, som initierer reseksjon.
Den homologe rekombinasjonsveien består av rekkefølgen av mange ikke-kovalente DNA-protein- og DNA-DNA-assosiasjoner som kan reverseres. Denne reverseringskapasiteten, kontrollert av mange proteiner, begrenser toksisitet, øker trofastheten og bestemmer reparasjonsproduktet (crossover eller ikke-crossover) av denne DNA-reparasjonsveien.
Reseksjon5'-3'-retningsnedbrytningen av DNA-strengen som flankerer bruddet kan reverseres ved DNA-syntese, initiert av Primase rekruttert ved bruddstedet av Shieldin- komplekset. Dette trinnet reverserer beslutningen om å iverksette reparasjon ved homolog rekombinasjon, og gjenoppretter muligheten for reparasjon ved hjelp av en " endeforbindelsesmekanisme ".
RAD51 filamentRAD51-filamentet dannet på enkeltstrenget DNA kan demonteres av mange helikaser hos mennesker, og Srs2 i gjæren S. cerevisiae . Disse aktivitetene motvirker utilsiktet dannelse av RAD51-filament, spesielt under replikasjon, og dannelsen av giftige strengutvekslingsmellomprodukter. Under DNA-reparasjon hindres denne demonteringen av paralogene til RAD51 som er tilstede i filamentet.
D-sløyfeMellomliggende mellomprodukter i D-loop kan demonteres av mange proteiner konservert i eukaryoter, slik som Mph1, Sgs1-Top3-Rmi1 og Srs2 i S. cerevisiae . Når denne demonteringen skjer før initiering av DNA-syntese på nivået av D-sløyfen, blir rekombinasjonsveien nedgradert til homologisøketrinnet. Disse demonteringsaktivitetene hemmer bruken av gjentatte sekvenser for reparasjon, og fremmer dermed genomets stabilitet.
Når demonteringen skjer etter DNA-syntese, tillater det tilknytning av den utvidede enden med den andre enden av pausen, og dermed fullføringen av reparasjonen med "Synthesis-Dependent Strand Annealing". Denne grenen av homolog rekombinasjon, som utelukkende resulterer i dannelsen av ikke-crossover, er den mest konservative for genomets stabilitet.
Teknikken av genet målretting , som gjør det mulig å innføre endringer i genotype av organismer, tjente Mario Capecchi , Martin Evans og Oliver Smithies den Nobelprisen i fysiologi eller medisin i 2007.