Den pyrosekvensering er en teknikk for DNA-sekvensering som tillater en rask sekvensering og billigere enn sekvensering ved hjelp av Sanger-metoden . Faktisk krever denne teknikken ikke kloning (og dermed spares tid og penger), og tillater direkte avlesning av sekvensen oppnådd etter sekvensering. Den er basert på prinsippet om "sekvensering ved syntese", hvor sekvensen utføres ved å påvise nukleotidet som er inkorporert av en DNA-polymerase . Pyrosekvensering er basert på påvisning, ved kvantifisering av lyset som sendes ut, av pyrofosfatet som frigjøres under kjedereaksjonen, derav navnet pyrosekvensering.
Prinsippet for pyrosekvensering ble først nevnt i 1993 av Pettersson, Uhlen og Nyren ved å kombinere den faste fase sekvensering ved anvendelse av magnetiske kuler pakket i streptavidin med rekombinant DNA-polymerase som ikke har noen 3'-5 aktivitet. 'Eksonuklease (som tillater korreksjon på tester eller proof- avlesning ) og påvisning av luminescens via den enzymatiske aktiviteten til luciferase . Det er derfor en blanding av tre enzymer (DNA-polymerase, ATP-sulfurylase og luciferase) og et nukleotid ( dNTP ) som tilsettes til en enkelt DNA-streng som vi ønsker å sekvensere, og inkorporeringen av nukleotidet følges for å måle mengden av lys som sendes ut. Lysets intensitet avgjør om 0, 1 eller flere nukleotider er innlemmet, noe som lar deg se hvor mange komplementære nukleotider som er tilstede på malstrengen . Blandingen av enzymer med det første nukleotidet fjernes deretter fra mediet før en annen blanding med det andre nukleotidet tilsettes. Denne prosessen gjentas med hver av de fire typene nukleotider til DNA-sekvensen til malstrengen er bestemt.
En annen pyrosekvenseringsmetode ble utviklet i 1998 av Ronaghi, Uhlen og Nyren. Et ekstra enzym, apyrase , tilsettes, hvis rolle er å nedbryte overskuddsnukleotidene som ikke er inkorporert av DNA-polymerasen. Dette gjør at enzymblandingen kan opprettholdes gjennom hele prosedyren, slik at enheten kan være selvforsynt. Et automatisert instrument basert på dette prinsippet ble introdusert på markedet året etter av selskapet Pyrosequencing.
Til slutt ble en tredje alternativ metode utviklet i 2005 av Rothberg og hans samarbeidspartnere. Den er basert på det opprinnelige prinsippet om å feste DNA som skal sekvenseres på en solid støtte, og sekvenseringen gjøres på samme måte som de andre metodene ved bruk av en mikrofabrikkert DNA-chip . Denne metoden muliggjorde DNA-sekvensering med høy gjennomstrømning og utvikling av et automatisert instrument som senere ble introdusert til markedet. Det ble den første neste generasjons sekvense instrument, banet vei for en ny æra i genomikk , med raskt fallende kostnader, slik at hele genom sekvensering til rimelige priser.
I prinsippet om "sekvensering ved syntese" tas en enkelt DNA-streng som skal sekvenseres, og dens komplementære streng syntetiseres deretter enzymatisk.
Pyrosekvenseringsmetoden er basert på påvisning av DNA-polymeraseaktivitet med et annet kjemiluminescerende enzym . I prinsippet gjør metoden det mulig å sekvensere en enkelt DNA-streng ved å syntetisere dens komplementære streng med hastigheten på ett par baser om gangen, ved å detektere hver gang hvilken base som er blitt tilsatt ved hvert trinn. DNA-malen er immobil, og oppløsninger av nukleotidene A , T , G og C tilsettes etter hverandre og fjernes deretter fra reaksjonen. Lys produseres bare når nukleotidløsningen utfyller den første uparede basen i matrisen. Sekvensen til nukleotidløsninger som produserer kjemiluminescerende signaler gjør det mulig å bestemme sekvensen til malstrengen.
Når det gjelder metoden som ble utviklet i 1998, hybridiseres den enkeltstrengede DNA-malen til en primer og inkuberes med enzymene DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase og apyrase og med substratene 3'-fosfoadenosin 5'-fosfosulfat (PAPS) og luciferin .
Fra pyrogrammet kan vi derfor utlede sekvensen fra størrelsen på toppene som er oppnådd. Videre, i tilfelle av en blanding av nukleotider ved den samme posisjon ( sekvens polymorfisme ), størrelsen av toppene gjør det mulig å kvantifisere mengden av tråder som bærer den ene eller den annen av nukleotidene.
For tiden er en av begrensningene med metoden at lengdene på individuelle avlesninger av DNA-sekvensen er rundt 300 til 500 nukleotider, noe som er mindre enn 800 til 1000 nukleotider som kan oppnås med avsluttede metoder. Kjede som Sangers metode. Dette kan gjøre genommonteringsprosessen vanskeligere, spesielt for sekvenser som inneholder en stor mengde gjentakelser . Mangelen på korrekturaktivitet begrenser nøyaktigheten av denne metoden.