Den NMR-spektroskopi er en teknikk som utnytter egenskapene magnet av bestemte atomkjerner . Den er basert på fenomenet kjernemagnetisk resonans (NMR), også brukt i medisinsk bildebehandling under navnet MR .
De viktigste applikasjonene for organisk kjemi er proton og karbon-13 NMR utført på flytende løsninger. Men NMR er også anvendelig for enhver kjerne som ikke har null- spinn , enten i flytende løsninger eller i faste stoffer. Visse gasser som xenon kan også måles når de for eksempel absorberes i porøse materialer.
I motsetning til NMR-spektroskopi av løsninger som rutinemessig brukes i akademiske eller industrielle laboratorier, forblir solid NMR litt mindre overkommelig uten en mer inngående kjennskap til NMR-fenomenet.
NMR-spektroskopi ble født i 1946 da Felix Bloch og Edward Mills Purcell , uavhengig av hverandre, foretok de første målingene av kjernemagnetisme ved magnetisk induksjon. De mottok Nobelprisen i fysikk for denne oppfinnelsen i 1952. Utviklingen var da en konsekvens: i 1950 oppdaget Erwin L. Hahn spinnekkoene ved bunnen av de mange flerpulseteknikkene som brukes i dag. Samme år oppdaget W. Proctor og W. Dickinson fenomenet kjemisk skifte , en grunnleggende oppdagelse for utviklingen av anvendelsene av NMR i organisk kjemi. I 1959 demonstrerte ER Andrew at rotasjonen av en prøve rundt en bestemt akse, den magiske vinkelen, gjorde det mulig å oppnå faststoff NMR resolved spectra (MAS NMR). Til slutt er et viktig skritt i utviklingen av måling av NMR-fenomenet utformingen av Fourier transform NMR-spektroskopi av Richard R. Ernst i 1966. Han mottok Nobelprisen i kjemi i 1991 for denne oppdagelsen og utviklingen i feltet. Flerdimensjonal NMR som denne teknikken tillot.
NMR-spektroskopi basert på deteksjonen av den fenomen NMR , noe som oppstår når kjernene i spinn forskjellig fra null, blir plassert i et magnetisk felt hovedsakelig ensartet utvendig og eksiteres av en strålingsradiofrekvens avstemt til energiforskjellen mellom de forskjellige mulige tilstander av kjernespinn.
Resonansfrekvensen (kalt Larmor-frekvens ) er i en første tilnærming direkte proporsjonal med det anvendte feltet :
hvor er det gyromagnetiske forholdet .
Det faktum at hver isotop har et unikt gyromagnetisk forhold gjør det mulig å innstille NMR-teknikken til et bestemt element. Det er tilstrekkelig å justere frekvensen av eksitasjon og observasjon på målkjernen.
Resonansfrekvensen til kjerner avhenger også av miljøet deres, da spinnene er i samspill med denne. Disse interaksjonene kalles interne interaksjoner i motsetning til de eksterne interaksjonene mellom spinnene og det eksterne magnetfeltet og radiofrekvensstråling. Disse intra- eller intermolekylære interaksjonene kan være magnetiske, slik det er tilfelle med kjemiske skift- og dipolkoblinger , eller elektriske, noe som er tilfelle med kvadrupolinteraksjonen . Tolkningen og målingen av disse interaksjonene gir verdifull informasjon om:
Når et molekyl plasseres i det ytre magnetfeltet , dannes lokale magnetfelt ved sirkulasjon av elektroner indusert i de forskjellige molekylære orbitalene under påvirkning av feltet. En ladet partikkel som beveger seg i et magnetfelt skaper faktisk et lokalt magnetfelt som ofte er motsatt det globale magnetfeltet ( B 0 ). Feltet som "kjennes" lokalt av kjernene er derfor ikke lenger akkurat det påførte feltet, men summen av B 0 og magnetfeltet skapt av elektronene.
Andre effekter kan oppstå som også sannsynligvis vil endre det lokale feltet, for eksempel elektronisk paramagnetisme , når det er delokaliserte elektroner (aromatiske kjerner, sterkt polariserte kjemiske bindinger, uparede elektroner, etc.) eller uparede elektroner som tvert imot øker feltet følte av kjernene. Det er da en paramagnetisk effekt .
Måten kjernen til hver resonansfrekvens påvirkes av de lokale feltene er preget av en skjermkonstant , som inneholder dia- og paramagnetiske bidrag:
Forskjellen i frekvens δ indusert av forskjellige elektroniske miljøer kalles vanligvis kjemisk skift .
Brukere NMR snakker ofte om rustning og avskjerming (på engelsk, skjerming og avskjerming ; skjold betyr "skjold") med referanse til størrelsen på skjermen hele tiden . Jo mer en kjerne er omgitt av elektroner, desto mindre føles det globale magnetfeltet B 0 og derfor er det mer skjermet og finnes til høyre for NMR-spektret (svakt δ). I kontrast, hvis en kjerne blir utarmet statistisk i elektroner ved tilstedeværelsen av et mer elektronegativt atom eller en mesomerisk tiltrekkende gruppe, så er den uskjermet og beveger seg til venstre for spekteret (høyere δ). Dette konseptet anbefales imidlertid ikke fordi det forsømmer de paramagnetiske effektene.
Kjemiske skiftvekterDet har alltid vært viktig å uttrykke kjemiske skift uavhengig av intensiteten av det magnetiske feltet som brukes, spesielt siden de første “kontinuerlig bølge” spektrometer anvendt en konstant observasjon frekvens (30, 60, 100 MHz , etc. ) og et variabelt eksternt magnetfelt (i dag, med pulsmetoder, er magnetfeltet vanligvis fast).
Vi bestemte oss derfor raskt for å lage en skala uten enhet i henhold til følgende formel:
(i ppm)det er å si :
Da forskjellen mellom resonansfrekvensen og resonansfrekvensen til referansen er i størrelsesorden ett hertz mens frekvensen til spektrometeret er i størrelsesorden megahertz (en million hertz), blir verdien oppnådd derfor uttrykt i deler per million ( ppm). Dette forutsetter imidlertid at vi har et referansestoff for hver kjerne.
I årene etter utseendet av kontinuerlig bølge-NMR var det egentlig ikke mulig å gjøre noe annet enn proton-NMR, takket være dens følsomhet og naturlige overflod. Siden svært få signaler oversteg 10 ppm (se nedenfor), ble skalaen T (Tau) brukt i 15-20 år med forholdet: τ = 10 - δ . Referansen for protonen var, og er fortsatt, tetrametylsilan (SiMe 4 ) internt (så blandet med stoffet).
Foreløpig brukes δ-skalaen eksklusivt .
ReferanserDen valgte referansen avhenger av den studerte isotopen.
I NMR i løsningFor eksempel for 1 H, 13 C og 29 Si, er tetrametylsilan (eller TMS) generelt valgt. De (relativt) kjemisk inerte referansene kan brukes internt , dvs. blandes i løsningsmidlet. Dette er tilfelle med TMS som er inert og lett å eliminere siden det koker ved 26,6 ° C , med en hastighet på ca. 0,03%. Ellers sies det at referansen er ekstern . I dette tilfellet utføres et første spektrum med forbindelsen som skal studeres, og deretter et sekund ved å sette inn en kapillær fylt med den "eksterne referansen". Det andre spekteret gjør det mulig å kalibrere det første spekteret riktig. Dette er spesielt tilfellet for fosfor 31 NMR, referansen som er fosforsyre (H 3 PO 4 ved 85%).
Det er også mulig å bruke en sekundær referanse, det vil si en forbindelse hvis kjemiske forskyvning er kjent. Ofte er dette restprotonene til det deutererte løsningsmidlet for protonen eller signalet fra løsningsmidlet hvis den inneholder kjernen som studeres. Denne metoden er imidlertid mindre pålitelig fordi den kjemiske forskyvningen av de interne sekundære referansene varierer med konsentrasjonen og spesielt pH i løsningen.
Tabellen nedenfor viser referansene som brukes til andre kjerner.
Kjerne | 1 time | 13 C | 31 s | 19 F | 29 Hvis | 6 Li & 7 Li | 15 N | 11 B |
Henvisning | TMS | TMS | H 3 PO 4 85% (ekst) | CFCl 3 | TMS | LiCl / H 2 O 1M (ekst) | MeNO 2 | BF 3 • Et 2 O (EXT) |
Kjerne | 1 time | 19 F | 23 Na | 27 Al | 67 Zn | 71 Ga | 115 tommer | 207 Pb |
Referanse i vandige oppløsninger (1 M) | TMS | CFCl 3 | NaNO 3 | Al (NO 3 ) 3 | Zn (NO 3 ) 2 | Ga (NO 3 ) 3 | I (NO 3 ) 3 | Pb (CH 3 ) 4 |
De magnetiske dipolinteraksjonene mellom to koblede spinn gir opphav til en variasjon i energi for deres respektive kvantetilstander, og endrer følgelig deres resonanser.
Denne interaksjonen kan eksistere enten direkte gjennom rommet (direkte dipolkobling), eller gjennom elektroner lokalisert i bindingsmolekylære orbitaler (kalt indirekte dipolkobling, skalar eller til og med J-kobling).
Direkte dipolkoblingerDirekte dipolkobling avhenger av avstanden mellom to vekselvirkende kjerner og deres gyromagnetiske forhold , og .
Intensiteten av koblingen (ofte kalt dipol konstant ) kan defineres (i Hz ) etter:
hvor er den magnetiske permeabiliteten til vakuum.
For eksempel har to protoner atskilt med 2 Å en dipolkonstant på - 59,311 kHz .
Skiftet i energinivåer gir en dipolsprengning, det vil si utseendet til en dublett i stedet for en enkelt resonans for hver av spinnene. Verdien av eksplosjonen er gitt av:
hvor er orienteringen til den internukleære vektoren , det vil si å forbinde de to kjernene, med hensyn til det påførte feltet .
er 3/2 hvis de to kjernene er identiske, for eksempel to protoner (homo-kjernekobling). Det er lik 1 i tilfelle av to forskjellige kjerner (hetero-atomkobling).
Hvis de molekylære reorienteringene er veldig raske som i væsker, forsvinner utbruddet, fordi gjennomsnittet avbrytes.
I faste stoffer er måling av den dipolære interaksjonen en kraftig måte å oppnå interatomiske avstander på.
Indirekte eller skalære dipolkoblingerDirekte dipolkoblinger (gjennom rommet) blir kansellert i væsker, men når det eksisterer en kjemisk binding, er spinnene fortsatt koblet via elektroner. Denne indirekte koblingen som motstår molekylære omorienteringer kalles derfor ofte skalar kobling (det vil si uavhengig av orientering). Det kalles også "J" -kobling i NMR-spektroskopi med referanse til konstanten som definerer dens intensitet ( n angir antall obligasjoner som skiller de to spinnene i og j ).
Når forskjellen i kjemisk skift i hertz (Δν) er større enn 5-10 ganger koblingskonstanten J (i absolutt verdi), sies koblingen å være av første orden . Under denne grensen sies koblingen å være andre ordre, og dette kan komplisere tolkningen betydelig.
Scalar dipol kobling er en utmerket indikator på tilstedeværelsen av kjemisk binding og en stor hjelp for å bestemme strukturer av organiske molekyler.
Den kvadrupolære interaksjonen gjelder bare atomisotoper med spinn lik eller større enn 1. Disse representerer omtrent 3/4 av de isotoper som kan observeres i NMR, blant hvilke atomer som er veldig viktige i kjemi, slik som oksygen ( 17 O), nitrogen ( 14 N ) og klor ( 35 Cl, 37 Cl).
Hovedkarakteristikken som skiller dem fra kjerner av spinn 1/2 som hydrogen ( 1 H) eller karbon ( 13 C) er tilstedeværelsen av et elektrisk kvadrupolmoment i tillegg til det kjernemagnetiske øyeblikket. Dette øyeblikket skyldes en anisotrop fordeling av ladninger i kjernen. Dette elektriske kvadrupolmomentet er i stand til å samhandle med en hvilken som helst elektrisk feltgradient som ikke er null på kjernenivået. Denne kvadrupolære interaksjonen er i stand til å modifisere energien til kvantetilstander veldig sterkt og påvirker derfor resonansfrekvensen og avslapningen.
Effektene på resonansfrekvensen forsvinner i væsker på grunn av rask omorientering av molekyler. Den kvadrupolare interaksjonen blir også null hvis kjernen i et fast stoff er lokalisert i et veldig symmetrisk miljø (sfærisk symmetri av den elektriske feltgradienten).
I de fleste tilfeller har ikke elektroner en sfærisk fordeling rundt kjernen. Denne fordelingen avhenger mye av molekylets geometri, det følger at de interne interaksjonene generelt er anisotrope .
I flytende løsninger er dette ikke viktig, fordi bare en gjennomsnittsverdi blir observert på grunn av de raske molekylære omorienteringene ( Brownian bevegelse ). I faste stoffer modifiseres derimot posisjonen til resonanslinjene sterkt avhengig av orienteringen av molekylet, av krystallet eller mer generelt av krystallitten.
I tilfelle av kjemisk skift, for eksempel, vil skjermkonstanten ikke lenger være representert av en enkel skalar , men av en andre ordens tensor , som definerer komponentene til skjermkonstanten i henhold til forskjellige romretninger. Det er alltid tre bestemte ortogonale retninger, dvs. et system med hovedakser , som kan velges som en referanseramme for å beskrive samspillet slik at tensoren er diagonal i dette aksesystemet. Så:
De tre skalarene , og tilsvarer verdien av skjermkonstanten i henhold til de tre hovedretningene. Denne tensoren kan representeres i form av en ellipsoid hvis form avhenger av symmetrien til interaksjonen. Spesielt hvis interaksjonen er av aksial symmetri ( ), er ellipsoiden en ellipsoid av revolusjon. Hvis alle tre verdiene er like, er systemet isotropisk og kan deretter beskrives av en enkelt skjermkonstant .
Resonansfrekvensen til hver kjerne vil avhenge direkte av skjermens tensor og kan skrives:
hvor vinklene og er de sfæriske vinkelkoordinatene som gir orienteringen til hovedaksen i forhold til magnetfeltet , og er Larmor-frekvensen,
Faste prøver blir ofte analysert i pulverform, det vil si at de inneholder et sett med krystallitt hvis retninger er tilfeldige. Det observerte resonansspekteret vil da tilsvare superposisjonen til resonansene til alle tilstedeværende krystallitter. Et slikt spektrum kalles et pulverspektrum og viser former som er karakteristiske for symmetrien til skjermtensoren.
Kjemisk skiftanisotropi er generelt betegnet med akronymet CSA (for kjemisk skiftanisotropi ).
Den dipolære interaksjonen er også anisotrop i faste stoffer, men har det spesielle å være aksialt symmetrisk.
Selv om NMR vanligvis brukes på diamagnetiske stoffer, er det ikke umulig å bruke det til paramagnetiske stoffer. I dette tilfellet er det spesielle effekter å være klar over, da de kan fortrenge eller utvide resonanser så sterkt at det ofte blir vanskelig å oppdage.
Ridderens trekkKnight K-skiftet karakteriserer NMR-frekvensen til atomkjerner i et metall (f.eks. Natrium) sammenlignet med det for de samme kjernene i et ikke-metallisk miljø (f.eks. Natrium i NaCl). Den observerte forskyvningen gjenspeiler de lokale magnetiske felt produsert på kjernene ved magnetisering av ledningselektronene. Dette generelt anisotrope skiftet kan være i størrelsesorden tusenvis av ppm. Den kjemiske forskyvningen av ikke-metalliske stoffer er ubetydelig ved sammenligning.
Kontakt forskyvning og pseudokontaktSentrifugeringen av uparede elektroner påvirker NMR-resonanser på to måter, ved kontaktforskyvning ( kontaktskift ) eller pseudokontakt ( pseudokontaktskift ). De to effektene er samtidig, men en av dem kan noen ganger være dominerende. Kontaktforskyvning skyldes polarisering av elektroniske spinn overført gjennom molekylære orbitaler. Pseudokontaktforskyvningen skyldes lokale magnetfelt produsert av paramagnetiske sentre (det er en dipolar elektron-kjerne-kobling som derfor varierer i 1 / r 3 ).
Som et eksempel er protonresonansen i nikkelocenen rundt -255 ppm, mens den i den diamagnetiske analoge forbindelsen ferrocene er rundt 5 ppm .
Selv om denne artikkelen fokuserer på NMR-teori, er det viktig å forstå hvordan teorien blir praktisert på spektrometernivå .
For hver prøve må du:
Den første saken kalles låsen på engelsk (“lock” på fransk, men dette begrepet brukes svært sjelden). Det er et spørsmål om å finne en frekvens i forhold til hvilken man kan bestemme at magnetfeltet varierer. Sistnevnte varierer uunngåelig fordi den superledende magneten tømmes, men dette er en veldig langsom prosess. På den annen side vil enhver gjenstand eller person som beveger seg i magnetfeltet skape plutselige variasjoner som raskt må kompenseres for.
Ved variasjon justeres eksitasjonsfrekvensen til de forskjellige kjernene. Den enkleste måten å finne en referansefrekvens på er å bruke deuteriumsignalet fra løsningsmidlet; et deuterert løsningsmiddel brukes til å oppløse forbindelsene, og tilstedeværelsen av deuterium i store mengder er en velsignelse. Spektrometeret utfører en frekvenssveiping for å observere forskyvningen av deuteriumsignalet og gjenspeiler denne forskjellen til alle kjerner.
På engelsk betegner begrepet "shim" en slags kil. Ved opprinnelsen til NMR var det virkelig nødvendig å plassere shims på visse steder for å homogenisere magnetfeltet. I dag har elektromagneter som er i stand til å generere magnetiske felt i forskjellige former, blitt lagt til for å kompensere for inhomogenitetene til den superledende magneten, men begrepet sitter fast.
Det angliserte verbet "shimmer" har derfor blitt vanlig i NMR og i forlengelse også i felt som bruker NMR. Vi kan derfor si fra et spektrum at det er god / dårlig “ shimmé ”. Når spektret er "dårlig shimmed", er signalene som observeres ikke symmetriske. Stier til høyre eller til venstre for signalet kan da observeres.
Shim- justeringen kan gjøres:
Den grunnleggende teknikken for å oppnå et NMR-spektrum består i å påføre en radiofrekvensfeltpuls langs x- eller y-aksen. Denne pulsen har en varighet (bestemt eksperimentelt) som gjør det mulig å oppnå maksimalt signal i deteksjonsspolen, dvs. ved å vippe magnetiseringsvektoren i xy-planet vinkelrett på z-aksen (som tilsvarer retningen til magnetfeltet B 0 ). Av denne grunn kalles denne typen puls for en / 90 ° puls . Som et resultat av denne pulsen måles tverrmagnetiseringen i xy-planet og konverteres til digitale data ved hjelp av en analog-til-digital-omformer mens den avtar på grunn av avslapning. Tre typer avslapning kan differensieres:
Det målte signalet (en oppkjøp , en skanning på engelsk) kalles vanligvis det frie presesjonssignalet , men oftere kalt FID (etter det engelske gratis induksjonsforfallet ) og fremstår som en sum av tilsynelatende uutkodbare sinusbølger. Faktisk er det ikke en eneste måling, men et gjennomsnitt av anskaffelser gjort etter hverandre. Dette gjør det mulig å øke intensiteten til de virkelige signalene i forhold til bakgrunnsstøyen (tilfeldig) som i gjennomsnitt er rundt null, det vil si at signal / støyforholdet økes ; for n anskaffelser økes signal / støyforholdet til kvadratroten av n . Den praktiske konsekvensen er at for å øke signal / støyforholdet med en faktor 4, vil det faktisk være nødvendig å multiplisere antall anskaffelser (og dermed tiden) med 16, dvs. 4 2 . Den tilsynelatende reduksjonen i FID skyldes relaksasjonen T 1 og T 2 *, men også eksperimentelle effekter knyttet for eksempel til effekten av paramagnetiske molekyler i prøven, slik som gassformig oksygen.
For å kjenne tegnet på resonansfrekvensene, er det nødvendig å foreta en synkron deteksjon i kvadratur, det vil si måling av to signaler forskjøvet i tid med en kvart Larmor-periode (solide og stiplede linjer på figuren nedenfor ). Hvert punkt i FID er derfor faktisk et komplekst tall .
Etter en mulig matematisk prosessering av signalet, påføres en Fourier-transformasjon for å trekke ut frekvensen til hver sinusoid fra FID og produsere et NMR-spektrum. Det faste linjesignalet kalles absorpsjonssignalet mens det stiplede signalet kalles spredningssignalet (det er en 90 ° faseforskjell mellom de to).
Den enkleste pulssekvensen er vist nedenfor: etter en forsinkelse d 1 genererer spektrometeret en sterk 90 ° puls ( p 1, p for puls på engelsk) og får deretter signalet (aq). Årsaken til å legge til forsinkelsen d 1 er at denne sekvensen gjentas et visst antall ganger, og at det er nødvendig, mellom to pulsopptak, for at systemet skal gå tilbake til likevekt.
Hvis den enkleste pulssekvensen kommer ned til en enkelt puls etterfulgt av måling av den resulterende FID, benytter moderne NMR-spektroskopi mye bruk av mye mer sofistikerte pulssekvenser, dvs. pulser på flere kjerner som tillater manipulering av kjernefysikken etter ønske. En viktig utvidelse av disse pulssekvensene er 2D (todimensjonal) og til og med n D (flerdimensjonal) spektroskopi, som spesielt gjør det mulig å etablere korrelasjoner mellom forskjellige resonanser.
For å eliminere defektene på grunn av elektronikken, til parasittiske radiofrekvenser eller for å eliminere visse gjenstander, blir pulser og deteksjon vekslet langs x-, x-, y- og y-aksene. Dette kalles fasesyklusen . Tillegget eller subtraksjonen av de forskjellige FID-ene i henhold til deres fase (positiv eller negativ) gjør det mulig å fjerne gjenstandene som i sin tur beholder det samme tegnet.
For et enkelt protonspektrum bruker vi vanligvis en åttetrinns fasesyklus:
derfor utføres den første skanningen med en puls langs x-aksen og deteksjon langs x. Den andre skanningen er identisk. Den tredje gjøres med en puls ved -x og deteksjon ved -x også osv.
Hovedkonsekvensen av denne fasesyklusen er at antall oppkjøp som gjøres alltid skal være et multiplum av antall trinn i fasesyklusen.
Anskaffelsestiden (AQ) kan ikke endres direkte. Det avhenger av to viktige parametere:
For lang anskaffelsestid representerer ikke noe problem, bortsett fra bortkastet tid. På den annen side vil for kort anskaffelsestid avkutte FID før den har blitt null. Dette medfører tap av signal, utseende av gjenstander etter Fourier-transformasjonen, og muligens tap av små koblingskonstanter (som tar lengre tid å utvikle seg). Se diagrammet motsatt.
Den avslapping tid , for ikke å forveksles med avslapning tid , til tilsvarer den tid som er nødvendig for alle spinner tilbake til sin grunntilstand. Det tilsvarer 5 * T 1 , hvor T 1 er den lengste spin-gitter avslapning tid av molekylet.
Mens Fourier-transformasjonen , som allerede er nevnt ovenfor, er grunnlaget for signalbehandling i NMR, er det mange andre viktige matematiske prosesser. Disse behandlingene er beskrevet nedenfor i den rekkefølgen som vanligvis brukes.
Tallene som tilsvarer et antall punkter uttrykkes generelt i "kilo" i datamaskins forstand av begrepet , det vil si at 1 k = 1024 verdier fordi det er kraften til 2 nærmest 1000 (2 10 ).
Som angitt ovenfor i Anskaffelsestid , må du angi spektralområdet (i Hz) som skal digitaliseres, samt antall punkter.
I følge spektrometeret kan antall poeng faktisk matche antall reelle verdier og imaginære, noe som betyr at antall komplekse verdier faktisk er halvparten av antall poeng : en FID 64K vil være en fil på 32 k reelle verdier og 32 k imaginære verdier. Totalt representerer dette 32k komplekse verdier.
Oppløsningen vil derfor være spektralområdet dividert med antall virkelige punkter, for eksempel 20 ppm i protonet ved 400 MHz utgjør 8000 Hz (20 x 10 -6 x 400 x 10 6 ). Hvis vi velger et antall punkter på 64 k , representerer dette en oppløsning på 0,24 Hz / punkt (20 × 400/2). Dette er veldig riktig i proton.
For å forbedre oppløsningen bruker vi ofte en nullfylling (det engelske begrepet), det vil si at vi legger til FID et visst antall punkter med en nullverdi; generelt er det totale antall poeng doblet. Vi bruker deretter en eksponentiell multiplikasjon (se Convolutions / windowing nedenfor) for å være sikker på at vi ikke har noen avkorting av signalet. Dette gjør det mulig å forbedre oppløsningen til signalet ved å dele det med to. Man skal imidlertid ikke håpe å avsløre koblinger som ikke ble oppdaget under anskaffelsen.
FID er en sum av sinusoider som skal være sentrert på null langs y-aksen. Et vertikalt skifte er mulig, og det kan kompenseres av NMR-behandlingsprogramvaren.
Et visst antall matematiske funksjoner brukt på FID (apodisering eller vindusvindu ) vil ha svært viktige effekter på det oppnådde spekteret. Blant mange andre:
Den sanne Fourier-transformasjonen er ikke anvendelig i NMR fordi den krever en integrasjon fra -∞ til + ∞. Vi bruker derfor det vi kaller en diskret Fourier-transformasjon og, enda mer, en rask Fourier-transformasjon som er en veldig rask algoritme, spesielt hvis antall verdier er en styrke på 2. Dette forklarer bruken av "kilo" i datamaskinsans for begrepet: en kraft på 2 ( ).
I et enkelt NMR-spektrum sies et signal å være "faset" når profilen er positiv og symmetrisk til venstre og til høyre. Spesielt må signalet utvides på samme måte til venstre og til høyre for å slå seg sammen med grunnlinjen.
Flere fenomener fører til at de oppdagede signalene er ute av fase med det ideelle tilfellet:
og
Dette trinnet utføres av NMR-behandlingsprogramvaren interaktivt med brukeren.
Kalibreringen utføres:
Hvis dette ikke er mulig, utføres en standardkalibrering av anskaffelsesprogramvaren.
Når fasen er justert riktig for alle toppene, kan NMR-behandlingsprogramvaren oppdage toppene (positive eller negative) ved deres ekstremum. Det engelske begrepet peak picking brukes ofte for dette trinnet.
Ideelt sett bør alle NMR-eksperimenter resultere i en flat baseline sentrert på δ-aksen, men dette er nesten aldri tilfelle. De forskjellige korreksjonsmetodene er:
Integrasjon er et enkelt tillegg av intensiteten til signalene mellom to verdier av δ. For at det skal bli godt gjort, må en integrering utføres mellom -5 og +5 ganger bredden i midten av høyden av den aktuelle toppen. Resultatet skal være en kurve som begynner og slutter med en vannrett linje.
Siden organisk kjemi er kjemien til karbon OG hydrogen, er NMR-spektroskopi et av de mest brukte analytiske verktøyene i organisk kjemi .
Kjernene som oftest er undersøkt er 1 H , 13 C , 31 P , 15 N og 19 F med kjernespinn lik 1/2. Også 17 O av spinn 5/2 og 14 N av spinn 1 ble undersøkt .
Prøven som skal analyseres, oppløses vanligvis i et løsningsmiddel, ofte deuterert kloroform , (CDCh 3 ) eventuelt inneholdende en liten prosentandel av tetrametylsilan. Dette løsningsmiddel er i stor grad anriket på deuterium ( 2 D , en isotop av hydrogen ), slik at den er usynlig i proton-NMR, slik at bare liten brøkdel observeres i NMR (ca. 0,2%) av gjenværende CHCI 3 .
Fremstillingen av et 1 H -NMR-spektrum er vanligvis hurtig (noen få minutter etter kjøpet). Ved å analysere de kjemiske forskyvningene av hver resonans og deres fine struktur (multiplett) på grunn av skalære koblinger , er det mulig å bestemme strukturen til mange organiske molekyler. Denne bestemmelsen blir gjort lettere ved også ved hjelp av 13 C NMR-spektroskopi i parallell . Den anskaffelse av en 13 C- spektrum er imidlertid lenger gitt meget lave naturlige rikelighet av denne karbonisotopforholdet (~ 1,1%).
Multidimensjonale NMR- spektroskopiteknikker brukes til å lette tolkningen av komplekse spektre.
NMR-spektrene har en kompleksitet som avhenger av molekylet og kjernen som studeres. I de fleste tilfeller innen organisk kjemi, vil vi basere oss på proton- NMR og karbon 13-NMR . Hvis spektrene er relativt enkle, kan vi tilordne signalene til de forskjellige kjernene ved hjelp av:
Hvis strukturen ikke kunne løses helt, kan andre enkle eksperimenter utføres:
Se:
Korrelasjonsspektroskopi er en type 2D (todimensjonal) eller noen ganger n D (flerdimensjonale) spektroskopi . Tabellen nedenfor gir noen eksempler på denne typen spektroskopi. Homonukleær spektroskopi er relatert til en enkelt type isotop og heteronukleær spektroskopi er relatert til to forskjellige isotoper.
Antall dimensjoner | Spektroskopi | Forkortelse | Fullt navn på engelsk |
---|---|---|---|
2D NMR | Homonukleær | KOSELIG | Spektroskopi korrelasjon |
STØY | Nuclear Overhauser effekt spektroskopi | ||
TOCSY | Total korrelasjonsspektroskopi | ||
Heteronukleær | HMQC | Heteronuclear multiquantum koherens | |
HSQC (en) | Heteronuclear Single Quantum Coherence | ||
HMBC | Heteronuclear Multi-Bond Connectivity | ||
HOESY | Heteronuclear Overhauser Effect Spectroscopy | ||
3D NMR (en) | Heteronukleær | HNCA (en) | Amid proton til Nitrogen to C α-carbon correlation |
HNCOCA (en) |
Flerdimensjonale spektre gir mer informasjon enn konvensjonelle endimensjonale spektre og er spesielt nyttige for å bestemme strukturen til et molekyl, spesielt de som er for komplekse til å studere ved hjelp av 1D-spektroskopi.
Foruten radiokrystallografi, har NMR blitt en metode for å studere biologiske makromolekyler i oppløsning. Det krever ikke å skaffe enkeltkrystaller og gjør det mulig å studere proteiner og nukleinsyrer i millimolære konsentrasjoner. Flerdimensjonale NMR-teknikker fører til å korrelere frekvensene til flere spinn og for å løse uklarheter knyttet til spektrale overlag. Proteiner med en molekylvekt på 10 til 30 kDa kan analyseres så vel som oligonukleotider av flere titalls basepar.
Historisk har proteiner blitt studert av NMR av protonen ( 1 H isotopen ) til stede i overflod.
Et første trinn er å tilordne resonansene, det vil si å etablere en korrelasjon mellom signalene fra spekteret og hydrogenatomene i molekylet. Det brukes to nøkkeleksperimenter , korrelasjonseksperimentet ved skalære koblinger ( HOHAHA eller TOCSY ) og korrelasjonseksperimentet gjennom rommet ved Overhauser-effekten ( NOESY ). Denne tildelingen sies å være sekvensiell, fordi den opererer ved relativ posisjonering av en kjerne i forhold til naboene ved bruk av informasjonen til peptidsekvensen. Denne fordelingsprosessen (ligner på et puslespill ) blir mer og mer kompleks etter hvert som størrelsen på proteinet øker; Dessuten overføres Overhauser-effekten gjennom rommet og gjør det ikke mulig å skille mellom kjerner nær i peptidsekvensen og de som er nær i rommet. Det er derfor mulig å oppdage feil som bare oppdages på slutten av prosessen, når visse brikker i puslespillet blir liggende på matten.
Når spektrene er tildelt, brukes informasjonen kvantitativt: skalære koblinger gir informasjon om tosvinklede vinkler og Overhauser-effekter på interatomiske avstander (opptil 4-6 ångstrøm). Denne informasjonen mates inn i molekylære modelleringsprogrammer for å finne en eller flere konformasjoner av molekylet som er kompatible med dataene. Strategien er sammenlignbar med den til landmåleren som måler avstander og vinkler mellom bygninger og beregner en byplan på nytt. Bortsett fra at rekkevidden til avstandene målt i NMR er liten sammenlignet med objektene som ble evaluert akkumulering av eksperimentelle feil og / eller det lave antallet data fører til lokalt dårlig definerte strukturer.
To vanskeligheter begrenser størrelsen på makromolekylene som er tilgjengelige for teknikken: kompleksiteten til spektrene og den individuelle bredden til hvert signal. Hvis størrelsen på proteinet dobles, vil antall resonanser i spekteret doble uten at dispersjonen (dvs. spektralbredden) øker. En løsning består i å bruke et NMR-spektrometer med høyere felt og derfor mye dyrere. Hvis størrelsen dobles, øker molekylmassen og proteinet spinner saktere på seg selv ved diffus bevegelse. Dette fører til bredere signaler, ettersom tverrgående avslapning blir mer effektiv. Økningen i magnetfeltet har ingen effekt, og vi må finne en annen løsning på problemet (reduksjon i viskositet , reduksjon i antall naboprotoner, etc.).
For å løse spektrale overlapp i store molekyler, var det nødvendig å bytte fra 2D NMR til 3D NMR. Mislykkede forsøk ble gjort tidlig på 1990-tallet for å kombinere HOHAHA- og NOESY-sekvensene i et tredimensjonalt eksperiment. Hvis vi har et protein som er fullstendig beriket i 15 N og 13 C, kan vi designe korrelasjonseksperimenter mellom spinn, basert utelukkende på skalære koblinger og la det være mulig å koble hele peptidryggen samt sidekjedene. De naturlig forekommende isotopene er henholdsvis 14 N ( kvadrupolær kjerne ) og 12 C ( usynlig kjerne i NMR ), men de fleste proteiner som oppnås ved bakteriell overekspresjon, er det mulig å lage kulturer på isotopisk beriket medium.
Denne nye strategien krever en serie med “ trippel resonans 3D ” eksperimenter : 3D fordi et tredimensjonalt spektrum oppnås, tredobbelt resonans fordi frekvensene til tre forskjellige kjerner oppdages. Av følsomhetsgrunner starter alle disse sekvensene fra 1 H (kjerne med høyt gyromagnetisk forhold) og slutter med påvisning av samme kjerne. I HNCO eksperiment , er en korrelasjon derfor etablert mellom protonet amid ( H N), dens nitrogen (N) og den karbonyl (CO) av den foregående aminosyrerest. De skalære koblingene som brukes til koherensoverføringer er 1 J- koblinger (til en lenke) og derfor relativt store ( 1 JNH = 90 Hz og 1 JNCO = 15 Hz ). Dette sikrer derfor høy overføringseffektivitet selv når det gjelder proteiner med høy masse (linjebredde). Merk at dette HNCO-eksperimentet gjør det mulig å koble aminosyrer ved skalar kobling, som den homonukleære strategien ikke tillot ( fravær av 3J skalar kobling gjennom peptidbindingen ).
I væsker forårsaker bruniske bevegelser veldig rask omorientering av molekyler, slik at bare gjennomsnittet av interaksjonene som er tatt over alle orienteringene blir målt. I faste stoffer er dette ikke tilfelle siden bevegelsene til molekyler ofte er mye langsommere enn målingen av NMR-signalet. Pulverspektrene er noen ganger veldig brede hvis mediet er veldig anisotropisk; spektrene er overlagret, og separasjonen av forskjellige kjemiske arter i henhold til deres kjemiske forskyvning er for eksempel derfor ikke så lett som i væsker.
På 1960-tallet viste Andrew imidlertid at det var mulig å oppnå spektra som tilsvarer det isotrope gjennomsnittet av interaksjonene ved å rotere prøven rundt en akse tilbøyelig av arccos (1 / √ 3 ) ≈ 54 ° 44 'med hensyn til magnetfeltet . Denne vinkelen kalles, den magiske vinkelen , og den magiske vinkelspinneteknikken blir generelt referert til ved akronymet: MAS (for magisk vinkelspinning )
En viktig forutsetning for at denne MAS-teknikken skal være virkelig effektiv er at rotasjonshastigheten er minst av størrelsesorden for anisotropiens amplitude. For å effektivt gjennomsnittliggjøre det dipolare samspillet mellom et 13 C- atom og et proton, må hastigheten eller rettere rotasjonsfrekvensen være i størrelsesorden 30 kHz (det vil si 30 000 omdreininger per sekund). Dette er svært høye hastigheter som bare kan oppnås ved å plassere prøven i små sylindriske beholdere (rotoren) plassert i rotasjon i en luftputeturbin. Hastighetene som nå oppnås med disse systemene er rundt 90 kHz .