Den elektroforese på agarosegel er en metode som brukes i biokjemi og molekylær biologi for å separere DNA , den RNA eller proteiner i henhold til deres molekylvekt .
Teknikken med agarosegelelektroforese er basert på separasjonen av negativt ladede nukleinsyrer under effekten av et elektrisk felt . Denne separasjonen foregår gjennom matrisen til agarosegelen : molekyler i mindre størrelser beveger seg raskere og vil migrere lenger enn molekyler i større størrelser.
Fordelene med agarosegelelektroforese er som følger:
Den viktigste faktoren er lengden på DNA-molekylet: separasjonen skjer i henhold til molekylmassen og derfor størrelsen på DNA. Imidlertid er DNA- konformasjon også en viktig faktor. Således, for å unngå problemene forbundet med denne konformasjonen, skilles bare lineært DNA på agarosegel (DNA-fragment resulterende fra fordøyelse, DNA amplifisert ved PCR eller til og med cDNA ).
Å øke konsentrasjonen av agarose i en gel reduserer migrasjonshastigheten og tillater separasjon av mindre DNA-fragmenter. Jo høyere spenning, jo mer øker migreringshastigheten. Spenningen er imidlertid begrenset i intensitet, faktisk induserer en høyspenning en temperaturøkning som kan smelte gelen.
Konformasjonen av plasmid-DNA, ikke fordøyd av et restriksjonsenzym , vandrer med forskjellige hastigheter (fra tregeste til raskeste): sirkulært DNA, lineært DNA og supercoiled DNA .
En 1% vekt / volum gel ( 1 g agarose per 100 ml sluttvolum) blir vanligvis brukt i elektroforese . Jo mer du vil ha en kresne gel, jo mer vil du øke prosentandelen agarose.
Agarose er en polymer basert på renset agar . Ulike renheter av agarose er tilgjengelig fra leverandører. Generelt brukes langsom størkningsagarose med høy renhet når DNA skal ekstraheres fra gelen etter migrering.
Det er et veldig mangfoldig antall tamponger. De mest brukte er Tris / Acetate / EDTA ( TAE ), Tris / Borate / EDTA ( TBE ) og natriumborat (SB).
Den TAE har den laveste bufferkapasiteten, men gir bedre separasjon av store fragmenter av DNA.
SB er relativt nytt og ineffektivt til å skille DNA-fragmenter større enn 5000 basepar ( 5 kb ). Imidlertid tillater den lave ledningsevnen bruk av høyere spenning (opptil 35V / cm), noe som reduserer migrasjonstiden betydelig.
DNA-fragmenter med bare noen få basepar av forskjeller separeres ved hjelp av en 3% agarosegel og med meget lav ledningsevne SB-buffer ( 1 mM litiumborat).
Eksempel på en 50 ml minigel beregnet på å skille fragmenter på 2 til 6 kb
| Agarosekonsentrasjon (% i m / V ) | Utvalg av ideelle størrelser (i kb ) |
|---|---|
| 0,3 | 5 - 60 |
| 0,6 | 1 - 20 |
| 0,7 | 0,8 - 10 |
| 0,9 | 0,5 - 7 |
| 1.2 | 0,4 - 6 |
| 1.5 | 0,2 - 3 |
| 2.0 | 0,1 - 2 |
For å visualisere migrering av elektroforese, er det først nødvendig å legge et fargestoff til gelen i en konsentrasjon som er foreskrevet av produsenten av interkaleringsmidlet eller å utføre en visualisering etter migrering. Den mest brukte avsløringsmetoden er åpenbaring med etidiumbromid eller BET. Etidiumbromid er et interkalerende middel som ofte brukes som en nukleinsyremarkør i molekylærbiologilaboratorier . Når den utsettes for ultrafiolett stråling , fluorescerer den med en rødoransje farge, 20 ganger mer intens når den er bundet til DNA . Denne effekten vil være på grunn av økningen i hydrofobiciteten i miljøet, snarere enn på en avstivning av benzenringen , hvor sistnevnte ikke befinner seg mellom baseparene . Etidiumbromid er imidlertid giftig og sterkt mutagent og bør håndteres med stor forsiktighet. Andre tryggere interkalerende midler som GelRed, SYBR Safe, gentian violet og metylenblått kan brukes.
GelRedGelRed er et fluorescerende fargestoff som brukes til å avsløre dsDNA, ssDNA eller RNA på agarose- eller polyakrylamidgeler. Det har egenskapene til å være svært spesifikk, veldig stabil og respektere miljøet. I tillegg er dens følsomhet overlegen etidiumbromid, og det krever ikke fargetrinn.
1. Tilsett GelRed til den smeltede agarosen for en sluttkonsentrasjon på 1X.
2. Hell gelen og fortsett med migreringen.
3. Visualiser migrasjonen med en UV-enhet.
SYBR SafeSYBR Safe er en agarose- eller polyakrylamidgel-flekk med høy følsomhet. Det fungerer som en intercalator for DNA så vel som RNA. Produsenten selger produktet i en styrke som allerede er klar til bruk. Visualiseringen av migrasjonen kan gjøres ved å stimulere midlet med UV-stråler eller til og med med blått lys.
Gentian fiolettGentian violet kan brukes som et visualiseringsmiddel for agarosegelelektroforese. Det er nødvendig å ha en stor konsentrasjon av DNA (100 ng og mer) for å migrere gitt den lave følsomheten til denne metoden. Sammenlignet med etidiumbromid, bør dette fargestoffet tilsettes i en konsentrasjon på 10 ug / ml i gelen så vel som i kjøringsbufferen for å oppnå tilstrekkelige resultater. For å øke følsomheten til metoden er det først mulig å avfarge gelen i vann etter at migrasjonen er fullført. Deretter anbefales det å utføre en ny farging i et stort volum av 0,1 X TAE-buffer som inneholder 10 ug / ml gentianfiolett på slutten av migrasjonen.
MetylenblåttMetylenblått kan brukes som en utvikler ved enden av migrasjonen på agarose eller polyakrylamidgel. Denne metoden krever en fargetid på opptil 15 timer gitt den lave følsomheten. Fordelen er ganske enkelt at den tillater ikke å bruke etidiumbromid, og at avfargingen kun krever destillert vann. Imidlertid induserer bruken av dette fargestoffet en bakgrunnsfarging som er vanskelig å fjerne, og dette gjør visualisering av båndene vanskeligere.
Alternativt kan gelen inkuberes i et bad som inneholder SYBR Green I (for dobbeltstrengede nukleinsyrer) eller SYBR Green II (også for å påvise enkeltstrengede nukleinsyrer). Den SYBR grønn har fordelen av lavere toksisitet og høyere følsomhet for å detektere lavere mengder av nukleinsyrer.
Teoretisk tillater agarosegelelektroforese separasjon av DNA-fragmenter i størrelse fra 50 basepar til flere millioner. Imidlertid blir det vanligvis brukt for separering av fragmenter i størrelse fra 100 bp til 20 kbp . Gjennomsnittlig migrasjonstid er en time.
Mindre nukleinsyrefragmenter skilles best med polyakrylamidgelelektroforese . Store fragmenter er vanskeligere å skille. Generelt er bruk av agarosegel i høy konsentrasjon (3 til 4%) da nødvendig for fragmenter på mindre enn 150 bp , fordi det gir bedre separasjon og oppløsning av de forskjellige båndene som en funksjon av størrelsesforskjellen. Den største ulempen er migrasjonstiden, som kan være opptil flere dager. For å overvinne disse problemene er det fordelaktig å utføre elektroforese med pulsfelt eller alternativt elektroforese med omvendt felt.
Etter migrering av elektroforese blir gelen belyst under ultrafiolett lys for å observere de fluorescerende DNA-båndene. Båndene kan deretter kuttes og skilles fra gelen, og deretter oppløses for å gjenvinne det rensede DNA. Størrelsen på fragmentene estimeres ved sammenligning med molekylstørrelsesmarkørskalaen (DNA-stige) som brukes samtidig i en annen brønn under migrasjonen.
Gelen blir vanligvis fotografert med et digitalt kamera. Selv om fargen på fluorescerende DNA er oransjerød, blir fotografiene publisert i svart og hvitt (se diagrammet nedenfor).
Elektroforesegeler som brukes til publikasjoner blir ofte analysert ved hjelp av dataprogramvare, for eksempel ImageJ .
| 1 | 2 | 3 |
|---|---|---|